A Klinefelter syndroma genotípusát a meiotikus non-diszjunkcióból származó, szám feletti X kromoszóma határozza meg. A kromoszómák osztódási hibája az ovogenesis vagy spermatogenesis folyamatában egyaránt bekövetkezhet. A szám feletti X kromoszómák csaknem egyforma gyakorisággal lehetnek anyai vagy apai eredetűek.

A mozaikos Klinefelter syndroma egy korai mitotikus osztódási non-diszjunkció eredménye. A KS kialakulásában a szülők életkora játszhat szerepet: a 40 évnél idősebb anyák esetében négyszer nagyobb a KS kockázata, mint a 23 éves anyák esetében. A KS férfiak esetében – akárcsak a nőkben – az egyik X kromoszóma a XIST gén (X Inactive Specific Transcript) expressziója révén inaktiválódik. Azonban az X rövid kar génjeinek egy része, az összes X gén hozzávetőlegesen 15 százaléka mentesül a transzkripció-gátlástól, és ezáltal hozzájárul a KS férfiak nőies fenotípusának kialakulásához.

Az X és az Y kromoszómák PAR1 régiójában található SHOX gén (Short Stature Homeobox) mindhárom kópiája aktív marad, ami megmagyarázza a kora gyermekkori magas termetet.

Egy másik genetikai marker, amely befolyásolja a Klinefelter syndroma fenotípusának alakulását az AR gén (Androgen Receptor) található CAG ismétlődések (nukleotid repeat) száma is befolyásolja a Klinefelter syndroma fenotípusának alakulását: a nagyobb számú ismétlődés csökkenti az androgénreceptor érzékenységét és szembetűnőbb fenotípust (kisebb herék, gynecomastia, nagyobb testmagasság) és gyengébb androgén terápiás választ eredményezhet.

A legfrissebb, teljes genom vizsgálatára kiterjedő tanulmányok közelebb hozták a KS és a hozzá gyakran társuló betegségek hátterében álló molekuláris mechanizmusok megértését. A KS betegek és 46,XY és 46,XX kontrollok metilom és a transzkriptom jellemzéséből kiderült, hogy mind az autoszómák, mind az X-kromoszóma metilomja és transzkriptomja egyedi a KS –ban. A KS epigenetikai és genetikai térképe különbözik mind a férfi, mind a női normális kariotípusú egyénekétől, a kódoló gének expressziós mintázata inkább a férfi nemhez hasonló.

A KS metilációs mintázatot túlnyomórészt hipermetiláció jellemzi, ami pontosan ellentéte a Turner-syndromában megfigyelhető hipometilációnak, ami azt mutatja, hogy az epigenetikai változás szerepet játszhat a nemi kromoszóma-rendellenességek fenotípusában. Megvizsgálva az expressziós és metilációs különbségeket mutató gének funkcionális kapcsoltsági hálózatát, számos olyan gént találtak, melyek szerepet játszanak az embrionális fejlődésben, a wnt-jelátvitelben, az immunrendszer és az idegsejtek fejlődésében és összefüggésbe hozhatók a KS-ra jellemző komorbiditásokkal.