A Humán Genom Projekt befejezése és az elmúlt évtized genomalapú technológiáinak a fejlesztése lehetővé tette az ismeretlen eredetű, veleszületett rendellenességek/fejlődési elmaradások genetikai hátterének pontosabb és hatékonyabb feltárását. Közleményünkben a nem tisztázott kóreredetű (idiopátiás) fejlődési rendellenességgel és/vagy értelmi elmaradással született betegek genetikai diagnózisára alkalmazható korszerű és konvencionális citogenetikai metodikákat, valamint használatuk észszerű algoritmusait foglaljuk össze. Az array komparatív genomiális hibridizáció (a-CGH) a nemzetközi gyakorlatban elterjedt, első vonalbeli citogenetikai vizsgálat, mely kópiaszám-változások (CNV) (deléciók, duplikációk) és kópiaszám-semleges heterozigótaság-vesztés (LOH) detektálására alkalmas nagy felbontóképességű (50Kb) vizsgálat. A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) fluorokrómmal jelzett DNS-próbákkal rekurrens törésponttal jellemezhető mikrodeléciós és mikroduplikációs szindrómák, valamint alacsony fokú mozaicizmusok azonosítására alkalmas vizsgálat. A standard metafázis-citogenetika technikai korlátai ellenére (5Mb, alacsony felbontás, osztódó sejtek) továbbra is értékes eszköz a kiegyensúlyozott kromoszóma-átrendeződések és a számbeli rendellenességek kimutatására.

 

 

The completion of the Human Genome Project and development of genome-based technologies over the past decade has enabled the recognition of chromosomal defects in higher proportion of patients with unexplained developmental delays. This review suggests a rational diagnostic algorithm for the targeted use of conventional and modern cytogenetic methods in patients with idiopathic developmental delay/intellectual disability. Array comparative genomic hybridization (a-CGH) has become the first-line investigation due to its higher resolution power (50Kb) for unbalanced lesions and for the detection of copy-neutral loss of heterozigosity. Fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis uses labelled DNA probes to identify submicroscopic deletions and duplications with recurrent breakpoints and low level mosaicism. However standard metaphase cytogenetics has technical limitations (5 Mb, low resolution, need of dividing cells) it remains a valuable tool for detection of balanced chromosomal rearrangements and numerical abnormalities.

 

Kulcsszavak: fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH), array komparatív genomiális hibridizáció (a-CGH), kópiaszám-változás (CNV), mikrodeléció, citogenetika

 

Keywords: fluorescence in situ hybridization (FISH), array-comparative genomic hybridization (a-CGH), copy number variation (CNV), microdeletion, cytogenetics

 

 

 

Az 1990-es évek elején elindult Humán Genom Projekt, az emberi DNS szekvenálási programja a teljes genom megfejtését tűzte ki célul. A tudósok és a mindennapi emberek egyaránt óriási lehetőséget láttak a program megvalósulásában: egyrészt abban bíztak, hogy rövid időn belül fény derül valamennyi mendeli öröklődésű betegség genetikai okára, megtalálják a szív- és érrendszeri betegségek, a stroke, a rák, a demencia, az asztma kialakulásáért felelős géneket, és a genom ismeretére alapozott gyógyszerkutatások lehetővé teszik új gyógyszer-támadáspontok felfedezését és a betegségek hatékonyabb gyógyítását. A program a vártnál korábban fejeződött be, óriási megfejtendő adathalmazzal látta el a kutatókat, és a szó szoros értelmében forradalmasította az orvosi diagnosztikai módszereket.

 

 

A ritka betegségek genetikai diagnózisa jóval korábban, a múlt század derekán indult, amikor Jo Hin Tjio és Albert Levan megállapította, hogy az emberi kromoszómakészlet 46 kromoszómából áll. A sejttenyészet gyors fejlődése lehetővé tette az emberi kromoszómák rutinszerű preparálását, és hamarosan megszületett a kromoszómákkal, azok öröklődésben és betegségekben betöltött szerepével foglalkozó új tudományág, a citogenetika. Az új tudományág hőskora létrejöttének első évtizedére esik: tíz év leforgása alatt azonosították az összes autoszomális kromoszóma számbeli elváltozásával járó szindrómát. Jérôme Lejeune felfedezte, hogy a Down-kórt a 21-es kromoszóma többlete, triszómiája okozza, a 13-as és a 18-as triszómiát felfedezőjükről Patau-, illetve Edwards-szindrómának nevezték el. A nemi kromoszómák többletével vagy hiányával kapcsolatosan újabb kórképeket írtak le: Patricia Jacobs és John Strong az XXY nemi kromoszómaképlettel társuló Klinefelter-szindrómát, Charles Edmund Ford és munkatársai a Turner-szindrómának megfelelő X monoszómiát írta le. Hamarosan fény derült arra is, hogy a spontán abortuszok nagy részét a magzat számbeli vagy szerkezeti kromoszóma-rendellenessége okozza. A fenti számbeli kromoszóma-elváltozással járó kórképek diagnózisa a mai napig – a hazai és a nemzetközi laboratóriumokban – kariotípus meghatározással történik (Haltrich, 2018). A szerkezeti rendellenességek azonosításához szükséges módszertani áttörés Torbjörn Caspersson nevéhez kötődik, akinek elsőként sikerült úgy megfestenie a kromoszómákat, hogy mindegyiknek egyedi „arca” legyen. A kromoszómák különböző sóoldatokkal történő kezelésével, az úgynevezett „sávozással” sokkal több részlet volt követhető a kromoszómákon, és a szerkezeti elváltozások azonosítása is lehetségessé vált. Elsőként Lejeune azonosította az 5-ös kromoszóma rövid kar terminális deléció­ját, melyet a macskanyávogáshoz hasonló sírás miatt „cri du chat” szindrómának neveztek el. Később más kromoszómákon is azonosítottak különböző méretű vesztéseket, visszatérő deléciókat, melyek közül a leggyakoribb a Wolf-szindróma (4-es kromoszóma rövid kar deléció) és a De Grouchy-szindróma (18-as kromoszóma parciális deléció). Szép lassan feltérképezték a kromoszómák szerkezeti rendellenességeit, melyek közül legismertebbek a transzlokációk, inverziók, deléciók és duplikációk. Általában elmondható, hogy a kiegyensúlyozatlan elváltozások okoznak betegségeket. Mivel az átrendeződések egyénenként különböző kromoszómarégiókat érintenek, mindegyik elváltozás különböző fenotípust eredményez, és ezért ritka betegségnek tekinthető.

 

 

Az in situ hibridizációt először radioaktív jelölésű genomiális DNS-darabokkal végezték el a 70-es évek tájékán, azonban a klinikai gyakorlati alkalmazása csak a 90-es években terjedt el, miután Daniel Pinkelnek és munkatársainak sikerült egy sokkal könnyebben kivitelezhető, fluorokróm-alapú DNS-festést alkalmazniuk.

 

 

A módszer előnye, hogy a fénymikroszkóppal nem követhető, kilóbázis nagyságrendű „rejtett” elváltozásokat képes detektálni: megállapítható a keresett kromoszómarégió, gén (szakasz) jelenléte vagy hiánya, kópiaszáma, kromoszomális helye (Tönnies, 2002). FISH-vizsgálattal csak akkor tudjuk diagnosztizálni a ritka betegségeket, ha rendelkezünk klinikai genetikai ismeretekkel, és ismerjük a beteg részletes tünettanát. A diagnózis kiindulópontja mindig a fenotípus (pheno­type-first), ennek a feltérképezése segít körvonalazni a lehetséges genotípust, melyet a célzott FISH-vizsgálattal tudunk igazolni.

 

 

A FISH legkiterjedtebb alkalmazási területe a ritka betegségek területén a mikrodeléciós szindrómák diagnózisa. A mikrodeléciók kialakulására a genomban szétszórtan található instabil kromoszóma-régiók hajlamosítanak. A mikrodeléciós szindrómákkal összefüggő instabil régiók közül legismertebbek az alacsony kópiaszámú ismétlődések (low-copy repeat, LCR), melyek a mikrodeléciós szindrómák töréspontjait határolják. Az ivarsejtek keletkezésével kapcsolatos meiózis során az egymáshoz közeli LCR-régiók szekvenciaazonosságának köszönhetően hibás párba rendeződés, úgynevezett „nem allélikus homológ rekombináció” jöhet létre, amelynek következtében az LCR-régiók közti szakaszok kieshetnek vagy megduplázódhatnak. Mivel a töréspontok mindig az LCR-régiókra lokalizálódnak, a mikrodeléciós szindrómák ismert, úgynevezett „rekurrens” törésponttal rendelkeznek. A mikrodeléciós szindrómák diagnózisára éppen ezért könnyen tervezhetők az úgynevezett génspecifikus vagy lókuszspecifikus FISH-próbák, melyekben a deléciós/duplikációs kritikus régiót általában piros fluorokrómmal jelölik, és tartalmaznak még egy zöld fluorokrómmal jelölt kontrollrégiót, amellyel ellenőrizhető a kromoszomális lokalizáció, és validálható a kritikus régióval kapcsolatos eredmény is. Valamennyi rekurrens törésponttal jellemezhető mikrodeléciós és mikroduplikációs szindróma (Williams–Beuren-, DiGeorge-, Smith–Magenis-, Prader–Willi-, Angelman-, cat-eye-, Charcot–Marie–Tooth-szindróma stb.) FISH-vizsgálattal biztonsággal diagnosztizálható (Shaffer et al., 2007). Ez a társadalombiztosítás által támogatott vizsgálat szinte valamennyi hazai citogenetikai laboratóriumban elérhető.

 

 

A ritka citogenetikai kórképek legkorszerűbb diagnosztikus módszere a nagy felbontóképességű array komparatív genomiális hibridizáció (array-CGH). Óriási előnye, hogy alkalmas sporadikus töréspontú, ismeretlen, kisméretű kópiaszám- változások (CNV) (deléciók, duplikációk) detektálására. A vizsgálat a beteg DNS-mintájából és egy egészséges kontrollmintából, az úgynevezett referencia DNS-ből történik.

 

 

Az array kitek próbatávolsága általában arányos a gének sűrűségével, a centroméra körüli génszegény régiók, szegmentális duplikációk általában nincsenek lefedve, ezért ezek kópiaszám-változásairól, valamint a mitochondriális DNS-ről nem kapunk információt. Az array-CGH nem alkalmas kiegyensúlyozott elváltozások (reciprok transzlokációk, inverziók), alacsony fokú (15%) mozaicizmusok, valamint mutációk detektálására sem.