Az elmúlt években robbanásszerű fejlődésnek lehettünk tanúi a genetikai vizsgáló módszerek terén, amely magával hozta a daganatok genetikai hátteréről szerzett ismereteink nagyarányú bővülését. Különösen igaz ez a vérképzőszervi daganatok, azaz az onkohematológiai kórképek esetében.

 

 

In recent years we witnessed unprecedented advances in the field of genomic technologies leading to a rapid expansion of our knowledge on the genetic background of various cancer types. This progress has been particularly pronounced in the field of hematological malignancies. Indeed, novel genetic lesions associated with the pathogenesis, progression and clinical behavior of cancer are still being discovered. Understanding the mutation targets allows development of selective targeted therapies, which are already available in majority of the malignant hematological diseases, and considering the genetic makeup of the patients represent a truly personalized therapeutic approach in combination with the standard chemotherapy or even as an alternative for the standard therapeutic protocols. In this review we summarize the advances of molecular diagnostic approaches used in oncohematology with a special focus on the most recent, cutting edge technologies.

 

 

 

 

 

Az elmúlt néhány évben robbanásszerű fejlődés következett be a genetikai vizsgáló módszerek területén, ami magával hozta az onkológia, és különösen az onkohematológia diagnosztikus, prognosztikus és terápiás tárházának nagyarányú bővülését. Több mint egy évtized telt el a Humán Genom Projekt befejezése, a teljes humán genom megismerése óta. Ez a hatalmas léptékű kutatás igényt támasztott a nagyobb áteresztőképességű, egyszerűbb és költséghatékonyabb technológiák kifejlesztésére a DNS-t alkotó bázisok sorrendjének meghatározásához, azaz a szekvenáláshoz. Az egészséges ember genetikai kódjának megfejtése óta a figyelem a betegséggenomok megfejtésére irányul, azzal a céllal, hogy az adott betegség kialakulásában kulcsfontosságú genetikai eltéréseket ismerjünk meg. Mivel a daganatos morbiditás és mortalitás népegészségügyi szempontból kiemelt jelentőséggel bír, a daganatgenomok feltérképezése fontos és sürgető feladat. Az elmúlt években sok ezer fős betegpopulációkon végzett szekvenálással meghatározták a legtöbb szolid daganat (például tüdőrák, vastagbélrák, melanóma) és hematológiai malignitás (különböző leukémiák és limfómák) genetikai összetételét. Ennek jelentősége egyfelől a daganatok biológiájának (kialakulásának, progressziójának, terápiarezisztenciájának) megértése; másfelől a diagnózis­alkotásban, a kórlefolyás becslésében, a hatékony terápia megválasztásában, a kezelés hatékonyságának felmérésében nyújt elengedhetetlen segítséget, és válik részévé a mindennapi patológiai diagnosztikának.

 

 

A CML nemcsak a célzott terápiáknak, hanem a kizárólag molekuláris vizsgálatokon alapuló betegkövetésnek és terápiatervezésnek, a valóban személyre szabott molekuláris diagnosztikának és kezelésnek is a modelljét jelenti. Optimális esetben a tirozin-kináz-gátló kezelés hatására csökken a BCR-ABL1 fúziós transzkriptum mennyisége, és a csökkenés mértéke (a molekuláris válasz szintje) alapján pontosan definiálható a kezelés hatékonysága (2. ábra E). A BCR-ABL1 fúziós transzkriptum szintjének alakulása az onkológiában egyedülálló módon közvetlen terápiás jelentőséggel bír. A fúziós transzkriptum mérése („molekuláris monitorozás”) RNS-ből komplementer DNS (cDNS) reverz transzkripcióját követően valós idejű polimeráz láncreakcióval (q-PCR) történik. A folyamat során a felsokszorozott cDNS-mennyiség arányos a kiindulási génexpresszió mértékével, amely fluoreszcenciaintenzitás alapú detektálással kvantifikálható. Ha a beteg meghatározott idő alatt nem éri el a kívánt csökkenést, egyéb tényezők mellett felmerül a terápiaindukált rezisztencia. Ennek hátterében leggyakrabban az ABL1-gén pontmutációi (egy-egy nukleotid cseréje) állnak, amelyek meggátolják az imatinib kötődését a fehérjéhez, amely így nem képes gátló funkciójának kifejtésére (2. ábra F). A rezisztenciamutációk vizsgálata Sanger-szekvenálással történhet, amelynek alapja a fluoreszcensen jelölt, lánctermináló didezoxi-nukleotidok beépülése a szintetizálódó nukleotidláncba, majd detektálásuk kapilláris elektroforézissel történő szeparálás és az egyes ddNTP-k eltérő fluoreszcencia­intenzitása szerint. Rezisztenciamutációk azonosítása esetén újabb generációs tirozin-kináz-gátlók (például dasatinib, nilotinib, bosutinib, ponatinib) is alkalmazhatók az újabb fejlesztések révén, amelyek imatinibrezisztens esetekben is hatékonyak az eltérő kötődési helyüknek és affinitásuknak köszönhetően. Az azonosított rezisztenciamutáció típusa, valamint a beteg társbetegségei meghatározzák, hogy az említett új tirozin-kináz-gátlók közül melyiknek az alkalmazása a legkedvezőbb. Ha a molekuláris monitorozás során a beteg meghatározott időn keresztül nagyon kedvező választ mutat, felmerül a tirozin-kináz-gátló elhagyásának lehetősége is. Ez az ún. kezelés nélküli remisszió (treatment-free remis­sion, TFR) napjaink legizgalmasabb kérdése és lehetősége CML esetén. Ezeket a betegeket a TFR idején még szigorúbban szükséges monitorozni, és a kismértékű fúziós transzkriptum-emelkedésre is figyelmet kell fordítani. A CML a célzott terápiák és a molekuláris vizsgálatok fejlődésének köszönhetően napjainkra egy kiválóan kontrollálható, megszelídített betegséggé vált, ahol már nem(csak) az a kérdés, hogy mivel kezeljünk, hanem az is, hogy a megfelelő mélységű válasz elérését követően hogyan ne kezeljünk. Ez a paradoxon néhány éve még elképzelhetetlen volt, és az onkohematológiai kutatások óriási léptékű fejlődésének köszönhetően vált valós lehetőséggé.

 

 

A CML terápiájában tapasztalt áttörés reményt adott a kutatóknak, klinikusoknak és elsősorban a betegeknek, hogy egyéb onkohematológiai kórképek esetén is megismételhető ez a látványos siker. E cél által vezérelve, az elmúlt évek teljes genomszekvenálási tanulmányainak köszönhetően egyre több daganat genomtérképét ismertük meg. Ehhez elengedhetetlennek bizonyult a szekvenálási stratégia fejlesztése, amely az ún. újgenerációs szekvenálás (next generation sequencing, NGS) révén valósult meg. Az NGS a masszív parallel szekvenáló technikák gyűjtőneve, közös jellemzőjük, hogy a Sanger-szekvenáláshoz képest lényegesen nagyobb áteresztőképességűek, érzékenyebbek, idő- és költségtakarékosabbak (3. ábra). Az NGS-technikák révén lehetőség nyílik a teljes génállomány vizsgálatára (whole genome sequencing, WGS), bár az eljárás magas költsége és interpretálási nehézségei (a génállomány 98%-a fehérjét nem kódoló intronikus szakasz) miatt nem terjedt el. A teljes kódoló régió (exom) vizsgálatára szolgáló WES (whole exome sequencing) értéke a csíravonali eltérések vizsgálatában rejlik, jellemzően az öröklött, ritka, nagyon heterogén genetikai hátterű betegségek esetén. A legelterjedtebb eljárás az onkohematológiai betegségek terén a célzott újraszekvenálás (az ún. génpanelek vizsgálata), amely egy adott kórképre jellemző, néhány tíz vagy száz gén célzott vizsgálatát jelenti (Kuo et al., 2017). Ez történhet egyedileg tervezett génpanelekkel, illetve már rendelkezésre álló, tematikus panelekkel (például a mieloid daganatokban leggyakrabban érintett ötven gén vizsgálatára szolgáló panel). Az NGS munkafolyamatában kiemelt jelentőségű a DNS- vagy RNS-templát megfelelő előkészítése (koncentrációbeállítás és minőség-ellenőrzés), ez nagyban befolyásolja a további lépések (könyvtárkészítés, szekvenálás) sikerességét. A szekvenálás során nyert adatok feldolgozása bioinformatikai algoritmusok segítségével történik, amelyek egy adott variánsra jellemző lefedettség és a mutációs terhelést jelző variáns allélfrekvencia mellett a mutáció biológiai hatásairól, pato­genitásáról is közölnek információt az elérhető adatbázisok alapján. Az NGS-technológia a megfelelő platform alkalmazása mellett a pontmutációk kimutatásán túl inszerciók, deléciók, fúziós transzkriptumok expressziójának, illetve a DNS-metilációjának a meghatározására is alkalmas eljárás.

 

 

Az NGS-technológia nagy áteresztőképessége és érzékenysége miatt egyre több hematológiai daganat diagnosztikájában válik fontos vizsgálati eszközzé, amelyek közül kiemelhető az akut mieloid leukémia (AML) példája, egy agresszív lefolyású kórkép, amelyben rendkívül fontos a gyors diagnózisalkotás a megfelelő terápia mihamarabbi megkezdéséhez. Az AML genetikai szempontból nagyon heterogén betegségcsoport, osztályozása molekuláris alcsoportokon alapul (Taylor et al., 2017). A korrekt klasszifikációhoz és rizikóbecsléshez számos kromoszomális és molekuláris eltérés vizsgálatára van szükség, amelyek egyedi vizsgálata időigényes és költséges folyamat a hagyományos technikákkal (kario­tipizálás, FISH, Sanger-szekvenálás). Éppen ezért jelent kiváló lehetőséget az AML diagnosztikájában az NGS alkalmazása. Sőt, a terápiás lehetőségek több évtizedes stagnálását követően, új célpontokkal szemben ígéretes új gyógyszerek váltak elérhetővé (például az FLT3-gátló midostaurin és az IDH2-gátló enasidenib). Mivel ezek a célzott gyógyszerek csak a megfelelő gének mutációinak jelenlétében alkalmazhatóak, a mutációs státusz néhány napon belüli meghatározása NGS-technológiával elengedhetetlen a megfelelő, személyre szabott terápiához. A technológia az AML-en kívül a krónikus limfocitás leukémia (CLL) célzott terápiájának indikálásában is fontos szerepet játszik. A CLL egy indolens (lassú lefolyású) leukémia, a betegek egy része nem reagál a hagyományos kemoterápiá­ra, és igen kedvezőtlen túlélést mutat. Ennek hátterében a „genom őrzőjének”, legfontosabb tumorszuppresszor génünknek, a TP53-génnek a mutációi állnak. Mivel ma már elérhetőek kismolekulájú, célzott gyógyszerek (ibrutinib, acalabrutinib) a TP53-mutációt hordozó betegek számára, rendkívül fontos a mutáció szűrése a kezelés megkezdésekor. Mivel az alacsony mutáns allélaránnyal jelen lévő mutáció esetén is megfigyelhető ez a kedvezőtlen kórlefolyás és a kemoterápia hatástalansága, lényeges a mutációk megfelelő érzékeny módszerrel történő kimutatása. A hagyományos Sanger-szekvenálás 20%-os érzékenységénél az NGS sokkal érzékenyebb, szenzitívebb módszer, amely alkalmas az alacsony mutáns allélarányú betegek azonosítására, így a specifikus gátlószerek a beteg rendelkezésére állhatnak. A CML-nél említett imatinibrezisztenciával analóg módon, a CLL-ben is kialakulhat a terápiaindukált ibrutinibrezisztencia. A döntően a BTK- és PLCG2-génekben kialakuló rezisztenciamutációk korai detektálása kulcsfontosságú a terápiás stratégia módosításának szükségessége miatt (4. ábra). Ennek kiváló módszere az NGS-technológia, illetve a később említendő digitális PCR-metodika is.

 

 

Az NGS-technológián túl további ígéretes, szenzitív és sokrétű módszert jelent a digitális PCR-technika. A konvencionális PCR-rel szemben, ahol a teljes templát amplifikációja egy reakciótérben (leggyakrabban 200 μl térfogatú PCR-csőben) zajlik, a digitális PCR során a kiindulási nukleinsav-molekulák külön reakcióterekben (akár több tízezer kompartmentben) amplifikálódnak, és egy-egy reakció­térben mindössze egy vagy néhány DNS-molekula található. A kompartmentképzés elérhető többek között ún. „microfluid” chip technikával, illetve az egyre nagyobb teret hódító droplet digitális PCR-(ddPCR) módszerrel. Manuális vagy automatizált dropletképzést követően olaj-víz emulzióban zajlik az amplifikáció, amely így hatékonyabb és szenzitívebb a hagyományos PCR-eljárásnál. A módszer előnye a valós idejű PCR-rel szemben, hogy abszolút kvantifikációt tesz lehetővé belső kontrollgén (ún. háztartási gén) amplifikációja nélkül. A módszer kiválóan alkalmas pontmutációk, egyes inzerciók és deléciók célzott kimutatására. Az NGS-technikával szemben a módszer ismeretlen eltérések azonosítására nem alkalmas, viszont ismert molekuláris célpontok detektálása (például JAK2 V617F, BRAF V600E) akár 10–4 érzékenységgel is kivitelezhető.

 

 

A kézirat elkészülését a Nemzeti Kutatási, Fejlesztési és Innovációs Hivatal NVKP_16-1-2016-0004 és KH 17/126718 pályázatai, a Magyar Tudományos Akadémia Lendület programja (LP95021), valamint a Magyar Tudományos Akadémia Bolyai János Kutatási Ösztöndíja és az Emberi Erőforrások Minisztériuma által meghirdetett Új Nemzeti Kiválósági Program Bolyai+ ösztöndíja támogatta.