A felsorolt nehézségek kiküszöbölése vált lehetővé a nagy áteresztőképességű újgenerációs szekvenálási platformok bevezetésével. Közös tulajdonságuk, hogy a szekvenálási reakció sokszorosan párhuzamosítva zajlik, vagyis egyszerre több millió DNS-szál gyors és pontos leolvasása történik meg. Egymás mellett ugyanazon reakcióban több tíz vagy száz gén szekvenciáját határozhatjuk meg teljes részletességgel. Így hatalmas mennyiségű genetikai információt kapunk sokkal rövidebb idő alatt, ráadásul sokkal kedvezőbb áron. A keletkező nagy mennyiségű adat elemzéséhez pedig ma már bioinformatikai szoftverek és online adatbázisok állnak rendelkezésre. Napjainkban világszerte működnek akkreditált minőségbiztosítási szervezetek, melyek feladata, hogy a géndiagnosztikai vizsgálatok minőségét javítsák külső minőségértékelő körvizsgálatok lebonyolításával, így téve egyre megbízhatóbbá a molekuláris genetikai laboratóriumokat és a teljes folyamatsort a mintavételtől a validált eredményekig.

Az NGS-technológia forradalmasította az endokrinológia területét is. Mivel számos endokrin betegség komplex multifaktoriális vagy multigénes etológiájú, valamint több hasonló fenotípust mutató állapot is merőben eltérő genetikai hátérrel rendelkezik, ezért az NGS-stratégia előnyösen integrálható a differenciáldiagnosztika sorába. Az újgenerációs szekvenálással egy adott génben nemcsak az esetleges hot spotok státusza azonosítható, hanem a gén komplett bázissorrendje is maradéktalanul leolvasható, az összes kódoló exonnal, intronikus szakaszokkal, esetenként promóter és nemtranszlálódó (UTR) régiókkal együtt. A célzott génpanelek összeállítása mellett pedig akár a teljes genom kódoló régiója is költséghatékonyan vizsgálható, kiegészítve a rutin klinikai teszteket. Az újgenerációs technológia használatával amellett, hogy biztosabb diagnózist kaphatunk, mélyebb részleteiben érthetjük meg egy-egy összetett endokrin tünetegyüttes patogenetikai hátterét, feltérképezhetünk betegségmódosító génvariációkat, illetve új terápiás célpontok felé is utat nyithatunk. Mára egyes újonnan átdolgozott szakmai irányelvek és revideált kritériumrendszerek szerint a genetikai eredmények diagnosztikus ereje egyre meghatározóbb. Sokszor a diagnózis felállításához nem szükséges megvárnunk több jellemző fenotípusos marker egyidejű megjelenését, ha a betegségre utaló akár egyetlen klinikai tünet mellett fedünk fel bizonyítottan kóroki mutációt.

Mint minden módszernek, az NGS-technológiának is vannak korlátai. Ezek közé tartozik, hogy az analízis során átlagosan egy–néhány tíz nukleotid eltérést képes megbízhatóan detektálni. Csak bizonyos kritériumok mellett használható a kópiaszám-változással járó nukleotid variációk vizsgálatára. Valamint a rövid nukleotid ismétlődéseket nem lehet pontosan meghatározni, mert a referencia-szekvenciához történő illesztés során műtermékek keletkezhetnek. Továbbá a gének kódoló szakaszától viszonylag távol elhelyezkedő promóter vagy szabályozó régiókat – ha azok kiemelt klinikai jelentőséggel nem bírnak – a szekvenálási reakció tervezése során többnyire mellőzik.

A bemutatott limitációk egy részét a korszerű digitális kariotipizálás (vagy más néven komparatív genom hibridizáció – array CGH) segítségével léphetjük át. A technika használatával képesek vagyunk a nagyobb kromoszómaszakaszok átrendeződésének, deléciójának vagy duplikációjának vizsgálatára, illetve a kópiaszám-változások kimutatására is a teljes genom szintjén. További előnye, hogy a hagyományos kromoszómafestéshez képest jóval érzékenyebb, nagyobb felbontású (50–60 Kb), és nem szükséges sejttenyésztés a metafázisos kromoszómák létrehozásához. A kétféle megközelítéssel gyakorlatilag a genetikai eltérések teljes spektruma felderíthető.

Az endokrinológiában számos példát találhatunk arra, hogy a klinikai gyakorlatban sikerrel alkalmazták az újgenerációs DNS vizsgáló módszereket. Ide sorolhatók a különböző multifaktoriális endokrinopátiák, az átfedő fenotípust mutató kórképek, az endokrin tumorok, illetve megemlítendő prenatális használata is, például az endokrin vonatkozású nemi kromoszóma-rendellenességek szűrése kapcsán.

Komoly differenciáldiagnosztikai kihívás elé állítja az endokrinológusokat a hipoparatireózis. A klinikai kép csökkent szérum kalcium- és emelkedett foszfátszinteket mutat, míg a keringő parathormon mennyisége nagyon alacsony, akár mérhetetlen. A hipoparatireózisok jelentős hányada másodlagosan szerzett állapot, leggyakrabban a nyak elülső részén végzett sebészeti beavatkozások, illetve a pajzsmirigy eltávolításának következménye. Emellett tumoros infiltráció, ionizáló besugárzás vagy autoimmun folyamat is vezethet a mellékpajzsmirigy destrukciójához. A primer vagy kongenitális hipoparatireózisok molekuláris genetikai háttere és öröklésmenete pedig rendkívül változatos. Egyaránt érintett lehet a mellékpajzsmirigy szövetállományának embrionális fejlődése, valamint a parathormon (PTH) képződésének és szekréciójának folyamata is. A primer formát feloszthatjuk szindrómás hipoparatireózisra, ahol egy komplex öröklött betegség része a mellékpajzsmirigy alulműködés. Autoszomális domináns öröklődést mutató típusa például: a DiGeorge-szindróma 1 és 2, a TBX1- vagy NEBL-gének hibáival, ahol a hipoparatireózishoz jellemzően timusz aplázia, immundeficiencia és szívfejlődési rendellenesség társul. A HDR-szindrómában, melynek oka a GATA3-gén mutációja, a hipoparatireózis fő kísérő tünete az idegeredetű siketség és a diszpláziás vesék előfordulása. A hipoparatireózis a Kenny–Caffey-szindrómáknak is részét képezi. További szimptómái az alacsony növés, az oszteo­szklerózis és a hosszú csöves csontok kortikális megvastagodása. Kialakulásáért a TBCE- és FAM111A-génekben bekövetkezett eltérés felelős. Esetükben leírtak mind domináns, mind recesszív öröklődést. A hipoparatireózis komponense lehet olyan kórképeknek is, melyek mitokondriális géndefektusokra vezethetők vissza (például a Kearns–Sayre-, MELAS-, MTPDS-szindrómák). A nem szindrómás, önállóan előforduló hipoparatireózisok közé tartozik a mellékpajzsmirigyek izolált hiánya vagy a familiáris hipoparatireózis. Ezek molekuláris hátterét egyrészt a GCM2-génhiba adhatja. A gén által kódolt glial cells missing homolog 2 kizárólag a mellékpajzsmirigyben kifejeződő, elsődleges transzkripciót szabályozó faktor. Másrészt a parathormont kódoló PTH-gén sérülése is okozhat ilyen klinikai képet, mert ennek következtében nincs működőképes parathormon-elválasztás. Illetve a kalciumszenzor (CASR) gén aktiváló mutációja, mely blokkolja a PTH-felszabadulást. A betegség X-kromoszómához kapcsolt recesszív formájában a SOX3 regulátor gén szerepét igazolták.

Ahogy a felsorolásból is látszik a primer hipoparatireózisok etiológiája nagyon különböző molekuláris genetikai eltérésekre vezethető vissza. Major tünetként pedig minden esetben hipokalcémiát és szinte detektálhatatlan szérum PTH-szintet tapasztalunk. Ezért nagy segítséget nyújt, ha a diagnosztikai lépések közé lehetőségünk van beiktatni a megfelelő kandidáns géneket célzó újgenerációs szekvenálást. Az átfogó génpanel tartalmazza a mellékpajzsmirigy fejlődési rendellenességeiben feltárt géneket, melyek főleg a csíralemezek differenciálódását és mRNS expresszióját kontrolláló transzkripciós faktorokat kódolnak (például GATA3, GCM2, TBCE, TBX1, SOX3), a PTH-jelátvitelért és -szekrécióért felelős géneket (például CASR, FAM111A, PTH) és a mitokondriális géneket. Az akkreditált laboratóriumokban jelenleg elérhető géndiagnosztikai csomagok 8–17 releváns gén mutációanalízisét tartalmazzák. A különböző platformokon végzett módszerek analitikai szenzitivitása minden esetben meghaladja a 99%-ot. A teszteket kiegészíthetik a nagy deléciók/duplikációk vizsgálatával is, azonban a hipoparatireózishoz kapcsolt génekben az irodalom szerint ezek elenyészve vagy egyáltalán nem fordulnak elő. A DNS-szekvenálás eredménye egyrészt megerősítheti a klinikai diagnózist, ezenkívül a megfelelő kezelés megválasztását is biztosabbá teszi. Sok esetben az aszimptomatikus egyenesági rokonok hordozóságának szűrésére és korai terápiájának elindítására is lehetőséget ad. Az NGS klinikai gyakorlatban való használatával az is megállapítható, hogy de novo mutációról van-e szó, vagyis az index páciens az első érintett-e a családban. Az NGS-eredmények akár módosíthatják az eddigi ismereteinket új patogén mutációk szerepének megvilágításával. Egy tanulmányban siketséggel és/vagy vese diszpláziával társult hipoparatireózisos betegeket vizsgáltak. Az esetek egy részében alátámasztották a korábban leírt GATA3-gén szerepét, azonban a csoport másik részében GATA3-génmutáció nem volt azonosítható. Ez a megfigyelés is felhívja a figyelmet a sokrétű és változatos genetikai háttérre és a nagy hatékonyságú szekvenálási módszerek jelentőségére.

Érthető, hogy milyen fontos az átfedő klinikai manifesztációjú kötőszöveti betegségek pontos definiálása, illetve ezeknek a három fő szervrendszert is érintő szisztémás kórképeknek az elkülönítése, például az önállón kardiovaszkuláris jegyeket mutató, kardinálisan aortatágulattal és -repedéssel járó familiáris mellkasi aorta aneurizmától (fTAAD) vagy a kanyargós artéria szindrómától (ATS). Továbbá a legfőképpen szkeletális vonatkozású Shprintzen–Goldberg-szindrómától és a veleszületett ízületi kontraktúrával járó pókujjúságtól (CCA), végül a főleg szemészeti anomáliákkal jellemezhető ektopia lentisz, illetve Weill–Marchesani-szindrómáktól.

Az esetek felismerése legtöbbször csak az életveszélyes és nem ritkán halálhoz vezető aortadisszekció után történik meg. Korai diagnózissal és időben elvégzett profilaktikus beavatkozásokkal a súlyos szövődmények elkerülhetők. A különböző laboratóriumok általában kiterjesztett, harmincgénes paneleket kínálnak, de a Marfan-szerű és az egyéb öröklődő kötőszöveti betegségekhez asszociáltan akár 67 gén egyidejű vizsgálatát is lehetővé teszik. Az utóbbi években egyre könnyebben hozzáférhető NGS-applikációknak köszönhetően nagy mennyiségű genetikai adat birtokába jutottunk, amely részletesebb betekintést enged ezen betegségek patomechanizmusába. Az új felfedezések alapján már körvonalazódni látszik a TGFB-útvonal és annak regulációs zavara mint közös kórélettani háttér. Ez idővel megváltoztathatja akár az osztályozást is. Emellett gyógyszeres kezelések felé is utat mutathat, mivel a közelmúltban ismertté vált, hogy a TGFB-kaszkád effektív antagonistái az egyébként hemodinamikai szabályzó angiotenzin II receptorblokkolók. Amellett, hogy csökkentik a vérnyomást, és ezáltal hatásosak az aneurizma formáció és az aortarepedés megelőzésében, a felborult, illetve felerősödött kaszkád gátlásában is részt vesznek.

Az oszteogenezis imperfekta esetében is az NGS-éra megjelenésével párhuzamosan új nomenklatúra került bevezetésre 2010-ben. Ez alapján a betegség klasszifikációjában sokkal nagyobb hangsúlyt kap a genetikai eredmény. A részletes genetikai tesztek jelentősége nemcsak az, hogy azonosítja az egyes OI-altípusokat, illetve elkülöníti a betegséget az egyéb multiplex csonttörésekkel vagy csökkent csonttömeggel járó átfedő fenotípusoktól, hanem segít eldönteni, hogy a visszatérő fraktúrák hátterében esetlegesen gyermekbántalmazás áll-e. Ez utóbbi akkor lehet alapvető, amikor nincs családi kórelőzmény, és az egyetlen uralkodó tünet a kisgyermekkori gyakori csonttörés. Epidemiológiai adatok szerint az újszülöttek és csecsemők körében a fizikai bántalmazás prevalenciája sokkal nagyobb, mint az OI előfordulási gyakorisága. Egy következő diagnosztikai nehézség, hogy az OI néhány klinikai képe, mint például a kék szklera, csecsemőkben normális jelenség is lehet.

Az OI patogenezisében szerepet játszó gének nagy mérete (például: a COL1A1­gén több mint ötven kódoló exonból áll) és száma, valamint változatos mutációs mintázata miatt jó hatékonysággal alkalmazható az újgenerációs szekvenálási módszer. Elég széles körű, húsz-harminc releváns gént magában foglaló, előre megtervezett NGS-panelek érhetők el. Ezek lefedik az oszteogenezis imperfekta autoszomális domináns formáit (COL1A1, COL1A2, IFITM5, PLS3), a rosszabb életkilátásokkal járó recesszív variánsokat (BMP1, CREB3L1, CRTAP, FKBP10, P3H1/LEPRE1, PLOD2, PPIB, SERPINF1, SERPINH1, SP7, TMEM38B, WNT1), az X-kromoszómához kapcsolt oszteoporózist (PLS3), a hipofoszfátáziát (ALPL) és az oszteoporózis pszeudoglioma-szindrómát (LRP5). A molekuláris genetikai laboratóriumok többsége a szekvenálást kiegészíti a nagyobb génszakaszokat érintő hibák vizsgálatával. Ezek az OI esetén kb. 1%-ot képviselnek, elsősorban a COL1A1- és COL1A2-génekben.

A MEN1-asszociált tumoros betegben valamely hasonló fenotípust eredményező gént is érinthet a hiba. Ez további három gén eshetőségére világít rá: a transzkripciót szabályozó CDC73 – hipoparatireózisos állkapocstumor szindróma (HPT-JT), a szérum kalciumérzékelő CASR – familiáris hipokalkiuriás hiperkalcémia (FBHH) és a tumorszuppresszor AIP – familiáris izolált hipofízis adenóma (FIPA). A genetikai vizsgálat elvégzése indokolt, ha két MEN-szindrómára jellemző tumor egyszerre jelenik meg, ha erősen gyanítható a MEN1 diagnózisa (például: többszörös mellékpajzsmirigy adenómák negyvenéves életkor előtt, visszatérő hiperparatireózis, a hasnyálmirigy szigetsejtes daganata), vagy ha a MEN1 atípusos megjelenésű, továbbá, ha a családban előfordult a betegség. A genetikai vizsgálat legfőbb haszna, hogy az igazoltan MEN1-szindrómás családokban a mutációhordozó állapot kizárása feleslegessé teszi a további klinikai szűrővizsgálatokat. Míg a tüneteket nem mutató családtag hordozóságának megállapítása segítheti az esetleg kialakuló daganatok korai felfedezését. A de novo állapotokban vagy ha a célzott génszekvenálás negatív eredményt ad, érdemes kiterjedt NGS-panelt végeztetni, ahol a MEN1 kódoló szakaszai mellett a további regulátorrégiók is analízisre kerülnek, illetve az egyéb átfedő szindrómák génjei is, melyek segítik a differenciáldiagnózist és a kezelés helyes megválasztását.

A medulláris pajzsmirigy karcinómával járó MEN2-szindróma érdekessége, hogy a kialakulásáért felelős RET-protoonkogén 90%-ban meghatározott pozíciókban mutálódik. Ezek a 10. és 11. exonok cisztein aminosavat kódoló (609, 611, 618, 620 és 634) kodonjaiban fordulnak elő a MEN2A esetén. A MEN2B-szindrómában pedig a 16. exon 918-as kodonjának és ritkábban a 15. exon 883-as kodonjának aminosavcseréi okozzák a betegséget. A RET-mutációk azonosítása mind a kórisme, mind a kezelési stratégiák tekintetében kritikus. Megfigyelték, hogy a RET M918T-mutáció esetén a tumor sokkal agresszívebb viselkedést produkál, ezért a diagnózist követően a lehető leghamarabb totális pajzsmirigy-eltávolítás javasolt. Valamint, ha a RET gén 634 kodonjában igazolódik az eltérés, még ötéves kor előtt szükséges a pajzsmirigy teljes szövetállományának preventív ablációja. Mivel ilyen szoros az összefüggés a genotípus és a betegség kifejeződése között, ezért nagyon fontos a talált mutáció patogenitásának meghatározása és klinikai interpretálása. A nagy áteresztőképességű NGS-technológiával a RET-protoonkogén teljes kiterjedésében, nagyszámú populációs mintán elemezhető, így a rohamosan gyarapodó szekvenciainformációkra támaszkodva az újonnan feltérképezett ritka variánsok patogén vagy polimorf jellege könnyebben értelmezhető. Öröklött RET-mutáció a sporadikus medulláris pajzsmirigyrákos esetek 1–7%-á­ban is jelen lehet, ezért ilyenkor is indokolt a genetikai vizsgálat, különösen, ha a tumor fiatalon jelentkezik.

Az újgenerációs nagy felbontású genetikai vizsgáló módszerek nemcsak az öröklődő betegségek és a csírasejtes mutációk vizsgálatának lehetőségét forradalmasították, hanem még inkább átszőtték a tumorgenetika területét. Használatukkal a szomatikus variánsok sokkal kisebb tumorarány mellett, akár 10% alatti allélfrekvencia esetén is detektálhatóvá váltak. Ez a határérték a klasszikus Sanger-szekvenálásnál még átlagosan 30% volt. Azonban ez egyfajta kihívást is jelent a megtalált klinikailag jelentős variánsok validálása terén.

Az endokrin vonatkozású daganatok közül viszonylag elterjedt a petefészekrák, mely igen rossz prognózisú, mivel megfelelően érzékeny és hatékony szűrőmódszerek híján általában előrehaladott stádiumban kerül felfedezésre. Az esetek kb. 10%-a vezethető vissza örökletes okokra, háttérben legtöbbször a BRCA1- és 2-gének hibájával. Pozitív diagnosztikai teszteredmény esetén – a talált mutáció típusától is függően –, önmagában a BRCA1-mutáció hordozása 40%-os rizikóemelkedést jelent petefészekrákra. Emellett egyéb, nem BRCA-gének is érintettek lehetnek a daganat kifejlődésében, melyek ugyancsak a DNS-hibajavító rendszer alkotóelemei; a bázispárosodási hibák és a DNS kettősszál törések helyreállításában, illetve a tumorszuppresszióban vesznek részt (például: ATM, BARD1, BRIP1 CHEK2, MLH1, MSH2,6, RAD51C,D, PALB2 és TP53). A petefészekrák szövettanilag, morfológiailag és funkcionálisan is meglehetősen heterogén csoportot képez. A klinikai és molekuláris genetikai tulajdonságok alapján azonban a sporadikus petefészek-tumorokat két nagy csoportra oszthatjuk. Egyfelől összetartoznak azok, melyek relatív stabil genommal és lassabb, lépésről lépésre haladó lokális tumorgenezissel jellemezhetők. A szerzett génhibák ez esetben a KRAS-, BRAF-, ERBB2-, PIK3CA-, ARID1A-, CTNNB1- és PTEN-génekben találhatók. Másfelől a sokkal agresszívebben viselkedő és kedvezőtlenebb kimenetelű, rosszul differenciált tumorok nagyfokú genomi instabilitással bírnak. Vezető genetikai anomáliaként itt pedig a TP53-, majd a BRCA1/BRCA2-gének szomatikus inaktivációja állapítható meg.

Mára legkevesebb tizenhat különböző génről ismert, hogy az öröklött petefészek-daganatok kialakulásának patomechanizmusában szerepet játszik. Az újgenerációs DNS-tesztek megoldást kínálnak a tumorhajlamot fokozó gének egyidejű vizsgálatára, valamint segítségükkel kialakítható a molekuláris diagnózis. Az Európai Klinikai Onkológiai Társaság előírása szerint egy új, a célzott terápia alapját képező gyógyszercsoport, az ún. poli-ADP-ribóz polimeráz enzim- (PARP) gátlók személyre szabott tumorterápiás használatához ismerni kell a BRCA-gének státuszát. Az NGS mint eszköz a már sokszor emlegetett előnyeivel (érzékenység, precizitás, gyorsaság és költséghatékonyság) a terápiás döntéshozatal elengedhetetlen részévé vált.

Azonban a már meglévő daganatok molekuláris tipizálása mellett sokkal kiemeltebb jelentőséget kapott a pajzsmirigygöbökből származó tűbiopsziás minták genetikai vizsgálata. A klinikai gyakorlatban ultrahangvezérelt aspirációs mintavételezéssel nyernek sejteket egy gyanúsnak ítélt pajzsmirigygöbből. Ennek citológiai feldolgozása során ítélik meg a malignitásra utaló jeleket. Az aspirációs citológiai módszer igen érzékeny, azonban az esetek kb. 20%-ában nem ad egyértelmű eredményt. Ilyenkor a diagnosztika nélkülözhetetlen részévé válhat a genetikai eredménnyel kiegészített citológiai lelet. A génmutációk jelenléte akár jóindulatú, atípusos vagy nem egyértelmű citológiát mutató göbökben egyaránt előrevetítheti a rosszindulatú átalakulás lehetőségét, így segítve a műtéti eltávolítás szükségességének megítélését. A pajzsmirigyben lévő tapintható és látható göbök gyakorisága a lakosság körében 4–7%, az 1–1,5 cm-nél kisebb göbök előfordulása nőknél eléri a 20–30%-ot is. Az epidemiológai adatokból látszik, hogy nagy számban történik rutin biopsziás mintavétel, amelyet sok esetben genetikai vizsgálat is kiegészít.

Több biotechnológiai cég fejlesztett kimondottan a pajzsmirigyszövet géndiagnosztikai elemzésére alkalmas NGS-módszert (Európában elsőként magyar fejlesztésű génpanel érhető el). A tesztek kiemelkedő szenzitivitási és specificitási mutatókkal, egy-két hetes átfutással adnak megbízható eredményt. A mutációs panelek a tumorgenom atlaszban megtalálható, a karcinogenezissel összefüggésben leírt géneket foglalják magukba különböző felbontásban és számban. A pajzsmirigyrákra jellemző, ún. driver gének mellett sokszor gyengébb vagy más tumorok esetén bizonyított hatású egyéb tumorszuppresszort és onkogéneket is tartalmaznak. Az újgenerációs platformokon pedig nem kizárólag a tu­mor­asszociált gének szekvenciaanalízisét végzik, hanem párhuzamosan génátrendeződéseket és akár mikroRNS-expressziót is detektálnak. Az így összegyűlő genetikai információkból komplexebb képet alkothatunk a pajzsmirigydaganatok kialakulásáról, mutációs mintázatáról, annak időbeni változásáról, vagy éppen a klinikai megjelenést, illetve terápiát módosító hatásairól.